안녕하세요. 디아이바이오 입니다.

오늘은 Gyrolab® 을 사용하여 인간 혈청에서 anti-AAV2 항체 분석을 매우 빠르고 유용하게 하는 방법을 소개하고자 합니다.

원문의 내용은 아래의 첨부 파일 항목에서 확인하실 수 있으며, 궁금한 사항은 언제든지 문의 부탁 드립니다.

* 보다 많은 이해를 돕기 위하여 번역 과정에서 혼동이 올 수 있는 원문 부분을 괄호를 이용하여 표시해 두었습니다. 

소개 인간 집단의 AAV 캡시드 (AAV capsids in human populations) 에 대한 기존의 면역 (Pre-existing immunity) 은 중화 항체의 존재가 유전자 치료 효과에 영향을 미칠 수 있기 때문 (presence of neutralizing antibodies can impact gene therapy effectiveness) 에 AAV 임상 연구의 유전자 전달 (gene delivery) 및 전임상 연구 (preclinical studies) 의 비인간 영장류 모델 (non-human primate models) 에 대한 도전을 제기합니다. 따라서 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 혈청형 (vector serotypes) 에 대한 면역원성 (immunogenicity)의 신속하고 정확한 측정 방법은 효과적인 유전자 치료법의 향후 개발에 필수적입니다. 이 연구에서는 Gyrolab® 플랫폼을 사용하여 총 AAV2 항캡시드 항체(TAb)를 검출하기 위해 자동화된 미세유체 면역분석(automated microfluidic immunoassay) 을 개발했습니다. 비오틴화(biotinylated) 된 Capture 및 detection (Alexa Fluor® 647 labeled) 시약으로 비어있는 AAV2  캡시드 (empty AAV2 capsids) 를 사용하는 가교 분석(bridging assay)을 개발하여 1시간 분석에서 31개의 인간 혈청(serum) 샘플을 스크리닝(screen)했습니다.

방법 빈 AAV2 캡시드는 EZ-Link Sulpho NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific) 및 1013개 입자/mL 캡시드(Sirion Biotech)의 mL당 10μg 비오틴을 사용하여 비오틴화되었습니다. 1013개 particles/mL의 빈 AAV2 캡시드는 제조사 권장 사항 (Thermo Fisher Scientific) 에 따라 두 가지 다른 염료-캡시드 비율로 표지된 Alexa Fluor 647이었습니다. 인간 개별 혈청 샘플은 Seralab 에서 얻었습니다. 분석은 Rexxip F 버퍼, Gyrolab Bioaffy™ 1000 CD 및 1%의 PMT 설정이 있는 Gyrolab xPlore™ CD 기반 미세유체 플랫폼을 사용하여 완전히 자동화하여 처리하였습니다.

결과 두 가지 다른 염료:단백질 비율로 표지된 비어있는 AAV2 캡시드가 조사되었으며, 가장 높은 Alexa Fluor 647이 표지된 AAV2 비율은 최상의 signal/background (S/B, Figure 2)를 보여줍니다.

1:2 의 capture : detect 비율 및 1:4 혈청 샘플 희석 (serum sample dilution) 도 배경에 대한 최적화된 신호를 생성 (produced optimized signal to background) 했으며, 이러한 조건을 혈청 스크리닝 분석에 사용했습니다. 최적화된 조건은 25%로 희석된 혈청 샘플, 비오틴화 capture molecule AAV2 를 1:2로 희석한 것과 검출 시약 Alexa Fluor 647-AAV2을 1:2 로 한 것이었습니다. 31개 샘플 화면의 결과는 각각의 스크린 결과(individual screened) 와 상관없이 낮은 배경을 보여주었습니다. 일반적인 스크리닝 컷오프(cut off) 는 평균 배경 + 3SD (mean background+3SD) 로 설정되었으며 이 컷오프를 사용하여 인간 혈청 샘플 세트(빨간색 삼각형 ; Figure 3) 에서 음성 대조군 (negative controls) 을 선택했습니다.

31개의 혈청 샘플을 스크리닝한 결과 20/31(65%)의 혈청 샘플이 계산된 스크리닝 컷 포인트를 사용하여 AAV2 면역 반응(AAV2 immune response) 에 대해 양성 (positive) 인 것으로 나타났습니다(Figure 4).

분석 실행 시간은 약 1시간이었고, 16개의 sample 이 CD에 3중 (triplicate) 으로 실행되었습니다.

결론 Gyrolab 플랫폼을 사용하여 AAV2 캡시드에 대한 전체 항체의 검출을 위해 1시간, 자동화된 미세유체 면역분석이 개발되었습니다. Capture (비오틴화) 및 detection (Alexa Fluor 647 표지) 시약으로서 비어있는 AAV2 캡시드를 사용하는 가교 분석을 사용하여 31개의 인간 혈청 샘플을 스크리닝했습니다. 결과는 65%(23/31)를 양성으로 분류하거나 분석 컷오프 (assay cutoff)를 초과했습니다.

이 분석은 인간 혈청에 존재하는 항체에 대한 스크리닝 도구로 사용하기 위한 낮은 (low) background 및 유용성 (utility)을 보여주었습니다. 연구의 한계는 작은 샘플 크기로 인해 통계적 관련성이 부족(lack of statistical relevance) 했지만 AAV2 항체에 대한 혈청 양성 및 음성 (serum positive and negative) 을 명확하게 식별하기 위해 컷 포인트가 설정되었습니다. 이 방법은 잠재적으로 전임상 연구 (preclinical studies) 를 위해 비인간 영장류 혈청 샘플과 함께 사용하도록 조정할 수 있습니다.