Gyros Protein Technologies 에서 제공된 자동화되고 소형화된 면역분석을 사용하여 유전자 치료에서 바이러스 벡터 생산을 지원하기 위한 바이러스 titer 및 숙주 세포 단백질 측정 방법을 소개해 드립니다. 해당 내용은 원문이 영문으로 되어 있으며 번역 과정에서 혼동이 있을만한 부분은 괄호를 이용하여 원문을 첨부해 두었습니다. 원문 파일은 아래에서 다운로드 하실 수 있습니다.

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원제 : Determination of viral titer and host cell proteins to support viral vector production in gene therapy using an automated, miniaturized immunoassay

Introduction

유전자 요법 치료의 급속한 발전으로 인해 rAAV (재조합 아데노 관련 바이러스 ;recombinant adeno-associated virus) 및 렌티바이러스 (lentiviruses), HIV-1 (인간 면역결핍증 바이러스 1 ;human immunodeficiency virus 1) 및 EIA (말(馬)의 감염성 빈혈 ; equine infectious anemia) 를 기반으로 하는 것을 포함하는 바이러스 벡터의 생산 최적화를 지원하기 위해 빠른 처리 시간을 가진 분석에 대한 큰 수요가 발생했습니다.

여기에서 우리는 바이러스 벡터의 준비 및 순도를 모니터링하는데 사용할 수 있는 Gyrolab® 시스템에서 실행된 세 가지 분석의 성능을 보고합니다.

• Progen AAV 역가 ELISA 키트를 Gyrolab 시스템으로 이전 및 최적화

• Gyrolab p24 Kit를 이용하여 p24 virus capsid protein을 정량하여 Lentivirus vector titer 분석

• 인간 배아 신장 세포주(HEK 293)에서 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물 측정

AAV2 — ELISA 키트를 Gyrolab 시스템으로 신속하게 전송

Progen Biotechnik GmbH (독일 하이델베르그) 의 샌드위치 ELISA 시리즈는 세포 배양 상청액 및 정제된 바이러스 제제에서 AAV 혈청형 1, 2, 3, 5, 6, 8 및 9의 정량적 측정을 가능하게 합니다. 분석은 온전한 AAV 야생형 비리온 (AAV wild type virions *비리온은 캡시드와 핵산으로 이루어진 온전한 형태의 바이러스 입자(virus particle)를 의미한다. 외피바이러스의 경우 외피를 포함한 온전한 구조를 비리온이라 한다.), AAV 재조합 비리온 또는 조립되고 온전한 빈 AAV 캡시드를 적정하는데 사용할 수 있습니다. AAV2에 대한 Progen ELISA 분석은 Gyrolab 시스템으로 전달 (transferred) 되었습니다 (그림 1).

AAV2 titer assay optimization

AAV2 캡시드 역가에 대한 분석을 전달하기 위한 방법 개발은 1½일 동안 6회 실행만 필요했습니다. 최적화에는 Gyrolab Bioaffy™ CD와 capture 및 detection 시약의 농도가 포함하는 것을 선택하였습니다.

Bioaffy 200과 비교하여 Bioaffy 1000 CD에 대한 분석은 표준 Rexxip A 희석제를 사용하는 현재 ELISA 방법과 비교하여 향상된 감도와 동적 범위를 보여주었습니다. detection 시약의 세 가지 농도(2.5, 5 및 10μg/mL)는 평행 곡선을 제공했으며 높은 신호/배경 비율 (signal/ background ratio)을 기반으로 5μg/mL의 시약 농도가 선택되었습니다(그림 2).

AAV2 titer assay performance

Gyrolab AAV2 면역분석에 대한 분석 범위는 ELISA 범위가 약 4 x 10⁷ – 2.5 x 10⁹ 입자/mL (2 로그) (그림 3) 인 5.4 x 10⁶ – 5.5 x 10⁹ 입자/mL (3 로그) 의 연속 1:2 희석으로 준비된 표준 곡선을 사용하여 확인되었습니다. 참고: Progen QC 인증서의 ELISA 데이터. Rexxip A 버퍼에 스파이킹된 AAV2 표준 및 2000, 100 및 10개 입자/분석에서 3개의 QC로 실행한 결과 우수한 정확도와 정밀도를 나타냈습니다(표 1). 분석 범위 내에서 3회 희석하면 평균 농도가 2.5 x 10¹⁰ 입자/mL이고 희석 선형성이 우수합니다(표 2).

Gyrolab AAV2 면역분석은 높은 처리량을 가능하게 했습니다 (96 데이터 포인트/h 또는 최대 960 데이터 포인트/작업일수).

Lentivirus — p24 바이러스 캡시드 단백질 측정

3명의 작업자가 4개의 기기에서 6회의 실행을 수행했습니다. Gyrolab p24 키트(면역분석 설계는 그림 4 참조)는 µg/mL에서 ng/mL에 이르는 렌티바이러스 농도의 생물공정 샘플을 분석하는데 필요한 희석 수를 최소화할 수 있는 광범위한 3-로그 작업 범위 (three-log working range) 를 제공했습니다(그림 5).

0.2–1000ng/mL 범위의 QC 샘플은 5% 미만의 실행 내 CV와 ≤6%의 실행 간 CV를 제공했습니다.

0.08–1250ng/mL 범위의 표준은 5% 이하의 실행 내 CV 및 ≤5.3%의 실행 간 CV를 제공했습니다.

Dilutional linearity before and after detergent lysis (세제 용해 전후의 희석 선형성)

p24 바이러스 캡시드 단백질은 일반적으로 렌티바이러스 생산의 역가를 결정하는데 사용됩니다. 세포 배양 상층액은 유리 및 바이러스 관련 p24를 모두 포함할 수 있으며, 비율은 정제 프로세스의 여러 단계에서 얻은 샘플 사이 또는 다른 바이러스 프로세스 사이에서 다양합니다. 바이러스 관련 p24를 방출하려면 바이러스 제제를 Triton™ X-100과 같은 적절한 세제로 처리하여 바이러스 막을 용해해야 합니다.

Gyrolab p24 Kit는 처리되지 않았거나 Triton X-100으로 처리된 샘플에서 p24의 양을 측정했습니다. 샘플 매트릭스는 4단계로 희석된 2개의 샘플에 대한 분석의 선형성에 의해 나타난 바와 같이 분석 성능에 거의 영향을 미치지 않았습니다 (표 3).

Determination of HEK 293 HCP impurities over a broad analytical range (광범위한 분석 범위에서 HEK 293 HCP 불순물 측정)

Cygnus Technologies에서 얻은 친화성 정제된 anti-HEK 293 항체는 anti-HEK HCP 비오틴화 포획 항체 및 Alexa 표지된 anti-HEK 293 검출 항체의 Gyrolab 샌드위치 설계에 사용되었습니다 (그림 6). 10 – 1000ng/mL의 광범위한 작업 범위가 분석에 대해 표시되었습니다 (그림 7).

DISCUSSION AND CONCLUSIONS

제조 및 생물공정 응용 분야에서 AAV 및 렌티바이러스 바이러스 벡터의 농도와 순도를 모니터링하는 데 적합한 3 나노리터 규모의 완전 자동화된 Gyrolab 면역분석법이 개발되었습니다.

• Quantitation of AAV2 capsid protein / AAV2 캡시드 단백질 정량

• Quantitation of lentiviral p24 viral capsid protein (Gyrolab p24 Kit) / 렌티바이러스 p24 바이러스 캡시드 단백질 정량

• Measurement of HEK 293 HCP impurities / HEK 293 HCP 불순물 측정

이러한 강력한 Gyrolab 면역분석은 ELISA에 비해 10배 적은 샘플 부피를 사용하여 넓은 동적 범위와 함께 빠른(1시간) 고품질 결과를 제공했습니다. 이러한 성능은 워크플로 효율성 이점과 함께 개방형 Gyrolab 플랫폼을 유전자 치료법의 개발 및 생산에 유용한 도구로 만듭니다.

Gyrolab Technology

Gyrolab 시스템은 Gyrolab Bioaffy CD의 미세 유체 형식에서 나노리터 부피를 사용하여 시료 추가, 세척 및 검출을 자동화하여 면역 분석 워크플로를 간소화합니다.